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| 牡蠣小胞蟲病診斷規(guī)程顯微鏡檢查組織法 |
| 發(fā)布者：chuge8 發(fā)布時(shí)間：2025/3/17 14:19:35 閱讀：189次 |
一、試驗(yàn)?zāi)康?br />
牡蠣小胞蟲�。∕yxidium marinum感染）是由粘孢子蟲門小胞蟲引起的牡蠣寄生蟲病，導(dǎo)致生長遲緩、死亡率高。顯微鏡組織法通過觀察病原體形態(tài)（如孢子囊、極絲、宿主細(xì)胞反應(yīng)）確診病情，為疫情監(jiān)控和防控提供依據(jù)。
二、基本原理
病原特征：
孢子囊：球形至橢圓形，壁雙層，內(nèi)含2-4個(gè)孢子母細(xì)胞。
孢子：成熟后具極絲和偽足，侵入宿主細(xì)胞。
宿主反應(yīng)：纖維化包膜形成，細(xì)胞壞死或增生。
染色原理：
Giemsa染色：孢子囊壁呈藍(lán)紫色，孢子內(nèi)容物淡藍(lán)色，宿主細(xì)胞核紅色。
Wright染色：增強(qiáng)對(duì)比度，孢子囊結(jié)構(gòu)更清晰。
三、試驗(yàn)步驟
1. 樣本采集
采樣部位：鰓、消化腺、閉殼�。纳x高發(fā)區(qū)域）。
采樣方法：無菌鑷子取組織塊（約5mm³），置于含抗生素（如青霉素）的PBS中保存。
運(yùn)輸條件：4℃冷藏，24小時(shí)內(nèi)處理。
2. 固定與包埋
固定液：70%乙醇或10%中****爾馬林，固定24小時(shí)以上。
脫水：梯度乙醇（80%→90%→100%）脫水，每級(jí)30分鐘。
透明：二甲苯2次，每次1小時(shí)。
浸蠟：石蠟（熔點(diǎn)52-56℃）包埋，60℃恒溫箱聚合。
3. 切片與染色
切片厚度：4-6μm，HE染色或Giemsa/Wright染色。
染色流程（Giemsa法）：
脫蠟至水：二甲苯→無水乙醇→梯度乙醇→蒸餾水。
染色：Giemsa染液（30分鐘）→清水沖洗。
分化：甲醇鹽酸緩沖液（pH 6.8）30秒。
水洗→封片（中性樹膠）。
4. 顯微鏡觀察
設(shè)備：光學(xué)顯微鏡（400×油鏡），配備暗場(chǎng)或相差顯微鏡增強(qiáng)觀察。
病原體識(shí)別：
孢子囊：圓形，壁光滑，內(nèi)部可見孢子母細(xì)胞核。
極絲：從孢子囊頂伸出，具黏性末端。
宿主反應(yīng)：纖維化包膜、炎癥細(xì)胞浸潤（如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）。
四、儀器與試劑
類別 具體要求
儀器 顯微鏡、恒溫箱、離心機(jī)、組織切片機(jī)、染色缸、蓋玻片、載玻片。
試劑 70%乙醇、福爾馬林、二甲苯、石蠟、Giemsa染液、甲醇、鹽酸、PBS、抗生素（青霉素）。
五、質(zhì)量控制
陽性對(duì)照：使用已確診病樣或人工感染樣本。
陰性對(duì)照：健康牡蠣組織。
染色質(zhì)控：確保染色均勻，無背景干擾。
六、數(shù)據(jù)記錄與判定
記錄內(nèi)容：每張切片觀察到的孢子囊數(shù)量、分布密度及宿主病變程度。
判定標(biāo)準(zhǔn)：
陽性：每100個(gè)組織細(xì)胞中≥5個(gè)孢子囊，或宿主細(xì)胞明顯纖維化/壞死。
可疑：1-4個(gè)孢子囊，需復(fù)檢。
陰性：無孢子囊及病理變化。
七、注意事項(xiàng)
樣本新鮮度：組織需盡快固定，避免腐敗影響診斷。
染色標(biāo)準(zhǔn)化：Giemsa染色時(shí)間需嚴(yán)格控制在30分鐘內(nèi)，避免過染。
生物安全：操作時(shí)穿戴防護(hù)裝備，廢棄樣本需高壓滅菌處理。
判讀培訓(xùn)：避免因操作者經(jīng)驗(yàn)差異導(dǎo)致誤判，建議結(jié)合圖像分析軟件輔助。
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